تولید سلولهای زایای مذکر از سلولهای بنیادی جنینی موش پس از هم -کشتی و یا افزودن bmp4 در محیط کشت و پیوند به بیضه موش بالغ مدل آزوسپرمی

تمایز سلول زایا از سلول های بنیادی جنینی در محیط in vitro روش جدیدی را برای مطالعه تکامل سلول زایا فراهم کرده است. در مطالعه حاضر، سلول های زایای تمایز یافته از سلول بنیادی جنینی به بیضه موش بالغ مدل آزوسپرمی تیمار شده با بوسولفان پیوند زده شد و نقش این سلول ها در فرآیند اسپرماتوژنز بررسی شد. واکنش ایمونوسیتوشیمی oct4 جهت تایید حالت غیرتمایزی و واکنش pcr ژن sry برای تعیین جنسیت سلول بنیادی جنینی موشی رده cce انجام شد. همچنین، تاثیر غلظت های مختلف bmp4 (0، 01/0، 1/0، 1، 5، 25، 50 و 100 ng/ml) بر میزان بقا و تکثیر سلول های بنیادی جنینی مورد بررسی قرار گرفت. سلول های بنیادی جنینی به مدت 1 روز جهت تشکیل اجسام شبه جنینی (مرحله اول القای سلول زایا) و سپس به مدت 4 روز در سیستم همکشتی با سلول های sto و سلول های فیبروبلاست جنینی موش و سیستم کشت ساده در حضور و غیاب 5 نانوگرم بر میلی لیتر bmp4 جهت القای تمایز سلول های زایای بدوی کشت داده شد (مرحله دوم القای سلول زایا). به منظور تکثیر و غنی سازی سلول های زایای بدوی، سلول های زایای تمایز یافته از سلول های بنیادی جنینی کشت داده شده در سیستم کشت ساده حاوی 5 نانوگرم بر میلی لیتر bmp4، به مدت 7 روز در حضور غلظت های مختلف اسید رتینوئیک (0-5 میکرومولار) در سیستم کشت ساده و سیستم همـکشتی با سلول های sto کشت داده شد (مرحله سوم القای سلول زایا). جهت القای تمایز سلول بنیادی اسپرماتوگونی از سلول های زایای بدوی، سلول های تمایز یافته از سیستم هم کشتی با سلول های sto دارای غلظت 3 میکرومولار اسید رتینوئیک به مدت 2 روز بر روی لایه تغذیه کننده سلول های سرتولی و در حضور و عدم حضور ترکیب سه فاکتور lif، bfgf و اسید رتینوئیک و نیز در سیستم کشت ساده حاوی سه ترکیب فوق کشت داده شد (مرحله چهارم القای سلول زایا). در مرحله بعد، کارآیی سیستم هم کشتی با سلول های سرتولی و سیستم کشت ساده به مدت 2 هفته در تکثیر و غنی سازی سلول های بنیادی اسپرماتوگونی بررسی شد (مرحله پنجم القای سلول زایا). در انتهای تمامی مراحل فوق، بیان ژن های mvh، ?6 integrin، 1 integrin?، stra8 و piwil2 با روش pcr کمی اندازه گیری شد. به علاوه، در انتهای مراحل 1-4، میزان بقا و تکثیر اندازه گیری شد و اثرات القایی سیتوکین های مختلف با استفاده از واکنش های ایمونوسیتوشیمی mvh که مارکر اختصاصی برای سلول های زایای بدوی و cdh1 که مارکر اختصاصی برای سلول های اسپرماتوگونی است در گروه های منتخب هر مرحله و گروه های کنترل مربوطه مورد ارزیابی قرار گرفت. در انتها سلول های حاصل از تمایز در انتهای مرحله 4 به بیضه موش بالغ مدل آزوسپرمی تیمار شده با بوسولفان پیوند زده شد. حالت غیرتمایزی و جنسیت xy این رده سلولی تایید شد. نتایج دوزیابی نشان داد که bmp4 با غلظت ng/ml 5 تاثیرات بهتری بر میزان بقا و تکثیر این رده سلولی داشته است. بیان تمامی ژن های مورد بررسی در اجسام شبه جنینی نسبت به سلول بنیادی جنینی افزایش یافته و این افزایش در مورد ژن های mvh، stra8 و piwil2 معنی دار بود. در انتهای مرحله دوم، میزان بقا و تکثیر افزایش معنی داری را در دو سیستم کشت ساده فاقد و دارایng/ml 5 bmp4 نشان داد. به علاوه، نتایج pcr و ایمونوسیتوشیمی نشان داد که بیشترین میزان بیان mrna و پروتئین mvh مربوط به سیستم کشت ساده دارای bmp4 بوده است. در مرحله سوم، بیشترین میزان بقا و تکثیر در سیستم کشت ساده فاقد اسید رتینوئیک مشاهده شد. نتایج pcr و ایمونوسیتوشیمی این مرحله نشان داد که بیشترین میزان بیان mrna و پروتئین mvhدر سیستم هم کشتی با سلول های sto دارای غلظت 3 میکرومولار اسید رتینوئیک می باشد. در مرحله چهارم، بیشترین میزان بقا و تکثیر و بیشترین میزان بیان ژن های mvh، stra8، piwil2 و ?6 integrin در سیستم هم کشتی با سلول های سرتولی دارای ترکیب سه فاکتور u/ml1000 lif، ng/ml1 bfgf وmµ2 اسید رتینوئیک مشاهده شد. نتایج ایمونوسیتوشیمی نیز نشان داد که بیان پروتئین cdh1 در گروه مذکور به صورت معنی داری نسبت به گروه کنترل سیستم هم کشتی با سلول های سرتولی بیشتر بوده است. سیستم های کشت مرحله پنجم نیز تاثیری در غنی سازی سلول های اسپرماتوگونی نداشت. به علاوه، پیوند سلول های مرحله چهارم پس از8 هفته نشان داد که سلول های پیوندی در قاعده لوله های منی ساز جای گیری نموده اند. تعداد سول های اسپرماتوگونی در گروه پیوندی به صورت معنی داری نسبت به گروه کنترل بیشتر بود. نتایج تایید می کند که افزودنng/ml 5 bmp4 در محیط کشت ساده در القای تمایز سلول زایای بدوی موثر است. به علاوه، غلظتmµ 3 اسید رتینوئیک در سیستم هم کشتی با سلول های sto در غنی سازی سلول زایای بدوی و سیستم هم کشتی با سلول های سرتولی دارای فاکتورهای lif، bfgf و اسید رتینوئیک در تمایز سلول اسپرماتوگونی از سلول زایای بدوی نقش دارد. پیوند این سلول ها در موش مدل آزوسپرمی منجر به ایجاد نتایج بهتری در تعداد اسپرماتوگونی گردید.